Wbrew pozorom, mikroskopia konfokalna nie jest wynalazkiem nowym. Jej podstawy teoretyczne oraz pierwszy działający mikroskop opracował już w 1955 roku Marvin Minsky. Jednak dopiero postęp ostatnich kilkunastu lat umożliwił wykorzystanie potencjału tej technologii.
Dzięki nowym technikom optycznym, laserom, powszechnemu dostępowi do komputerów o niewyobrażalnej jeszcze 50 lat temu mocy obliczeniowej, a także rozwojowi biotechnologii i opracowaniu całego szeregu barwników fluorescencyjnych, umożliwiających wizualizację preparatów, mikroskopia konfokalna stała się potężnym narzędziem w rękach biologów i lekarzy.
Na czym polega mikroskopia konfokalna i jaka jest jej przewaga nad zwykłą? Bardzo dużym ograniczeniem tradycyjnych mikroskopów świetlnych oraz mikroskopów fluorescencyjnych jest grubość badanego preparatu.
Bez względu na źródło światła i jakość obiektywów, jesteśmy w stanie obserwować z zadowalającą ostrością i rozdzielczością tylko preparaty cienkie. W przypadku grubszych pojawia się poważny problem w postaci tła – nawet jeśli ustawimy ostrość na interesujący nas obiekt, obraz będzie zaburzony tym, co znajduje się pod nim i nad nim. Światło, które docierać będzie do okularu lub czytnika kamery, pochodzić będzie z całej grubości preparatu.
Poszczególne warstwy preparatu i leżące w nich obiekty będą się po prostu nawzajem zasłaniały. O ile możliwa jest przy ich wizualizacja dużego powiększenia ultracienkiego skrawka tkanki, o tyle obejrzenie z zadowalającą ostrością obiektu tak grubego, jak cała komórka ludzka (mierząca aż kilka tysięcznych milimetra grubości!) jest już niemożliwe.
Komórki nowotworowe linii HeLa. Na zielono zabarwione białko p53. Niebieskim kolorem wybarwione jądro komórkowe, na różowo i czerwono białka czaperonowe. Pozostałe kolory powstały w wyniku nałozenia się kolorów i świadczą o kolokalizacji białek. Dzięki uprzejmości Macieja Olszewskiego z Zakładu Biologii Molekularnej IIMCB w Warszawie.
I tutaj właśnie z pomocą przychodzi technika konfokalna. Dzięki skomplikowanemu systemowi soczewek, zwierciadeł, przesłon i wzmacniaczy możliwe jest obserwowanie światła pochodzącego tylko i wyłącznie z jednej, cienkiej warstwy preparatu – jednej płaszczyzny ostrości (tzw. płaszczyzny fokalnej).
Bez fizycznej ingerencji w preparat i cięcia go na ultracienkie warstewki, jesteśmy w stanie "pociąć" go światłem i obserwować jego dowolne płaszczyzny (zarówno poziome i pionowe). Co więcej, składając obrazy poszczególnych płaszczyzn, jesteśmy w stanie odtworzyć z dużą rozdzielczością i zwizualizować strukturę przestrzenną obserwowanego obiektu (na przykład uzyskać trójwymiarowy obraz komórki).
Do barwienia preparatów do mikroskopu konfokalnego używa się barwników fluorescencyjnych. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania światła własnego, wywołane pochłonięciem przez ciało kwantu promieniowania elektromagnetycznego.
Substancje zdolne do fluorescencji, tak zwane fluorofory, wzbudzone fotonem emitują światło. Z zasady jest to światło o większej długości fali niż długość fali światła wzbudzającego (a więc fala emisji jest przesunięta w stronę czerwieni). Przykładowo zielone białko fluorescencyjne (GFP) świeci na zielono, wzbudzone światłem UV.
Każdy z fluoroforów ma charakterystyczny dla siebie zakres długości fal wzbudzenia i emisji. W chwili obecnej znanych i stosowanych jest kilkadziesiąt tego typu barwników – niektóre z nich ze względu na niską toksyczność lub całkowity jej brak umożliwiają wizualizację technikami konfokalnymi żywych komórek i organizmów. Co więcej, dobierając odpowiedni zestaw fluoroforów i odpowiednie filtry regulujące długość fali wzbudzenia jesteśmy w stanie obserwować jednocześnie kilka substancji wybarwionych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi.
Szczurza komórka neuronalna, z hodowli pierwotnej zarodkowych neuronów z hippocampu wybarwione białka cytoplazmatyczne. Dzięki uprzejmości Anny Zarębskiej z Laboratorium Biologii Komórki IIMCB w Warszawie.
Mikroskopia konfokalna znalazła główne zastosowanie w naukach biomedycznych. Dzięki wyjątkowo wysokiej rozdzielczości optycznej, wyeliminowaniu światła tła i możliwości obserwowania preparatów o znacznej grubości, możliwe jest obserwowanie lokalizacji poszczególnych składników komórek i odtwarzanie ich struktury trójwymiarowej na utrwalonych preparatach, a także przeprowadzenie całego szeregu obserwacji na komórkach i organizmach (np. nicienie) żywych. Dzięki mikroskopii konfokalnej, można "na żywo" obserwować przemieszczanie się organelli komórkowych, transport, dyfuzję i interakcje białek (techniki FRET i FLIP).
W dobie proteomiki mikroskopia konfokalna staje się niezastąpionym narzędziem badawczym – jej wprowadzenie do powszechnego użytku spowodowało drastyczny skok naprzód w biotechnologii, biologii komórki i medycynie molekularnej. To, czego często nie można było wykazać metodami biochemicznymi, można teraz po prostu zobaczyć...
Jak dotąd jedynym ograniczeniem jest liczba barwników fluorescencyjnych, które można obserwować jednocześnie, moc obliczeniowa systemów komputerowych przetwarzających obraz i… niebagatelna cena mikroskopów (w całej Polsce jest zaledwie kilkanaście systemów konfokalnych).
CIEKAWOSTKA
Jednym z niezwykle powszechnych, naturalnie występujących w przyrodzie fluoroforów jest barwnik roślinny – chlorofil. Ten zielony barwnik, wzbudzony promieniowaniem ultrafioletowym, emituje światło czerwone. Można się o tym przekonać w bardzo prosty sposób – wystarczy kilka liści szpinaku, trochę alkoholu i tester do banknotów lub diodę UV. Chlorofil dobrze rozpuszcza się w alkoholu – wystarczy drobno pociąć liście szpinaku i zalać je na kilka dni alkoholem (zostawić w ciemnym miejscu). Po odcedzeniu otrzymamy alkoholowy ekstrakt zawierający m.in. chlorofil – teraz wystarczy umieścić go w przezroczystym szklanym naczyniu i podświetlić w ciemności, testerem do banknotów lub diodą UV. Zielony płyn zacznie świecić na... czerwono.
Jakub Urbański
